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貨號:Cat. No. T91202-5   Size: 5次(試用裝)
貨號:Cat. No. T91202-50     Size: 50次
—— 產品介紹
     本產品是經過精心優化的、基于MMLV逆轉錄酶和Taq DNA聚合酶的雙酶一管式RT-PCR試劑盒,它含有除模版RNA和其專一性引物以外的所有RT-PCR試劑,包括MMLV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶、RT-PCR緩沖液等,可以在同一反應管內完成 RNA→cDNA→PCR反應 (RT-PCR 反應)。
—— 產品特色
1、一管式完成RT-PCR反應,避免樣品交叉污染,尤其適合臨床應用。
2、即開即用,用戶不需要單獨準備RT-PCR所需的各種試劑。
3、主要成分只有兩個RT-PCR buffer和MMLV-Taq Mix,將加樣步驟減少到最低,極大降低了加樣誤差,增加了可重復性。
4、使用范圍廣,適用于從病毒RNA到人RNA的各種RNA模板。
5、高靈敏度,每個RT-PCR體系最低可以檢測200拷貝的RNA分子,可擴增的模版RNA的最長達2000 nt。
6、所得RT-PCR產物可以直接用于AT克隆。
—— 操作步驟
注意:所有離心管用前最好全部短暫離心幾秒使管壁上溶液沉淀到管底。下面以一個30μL體系的RT-PCR為例,如果體積不同,各成分用量需要適當調節。
1.  在一干凈的無RNase的PCR管中,先加入下列成分:
成分
陰性對照
樣品
RNA模板(自備,分下面三種情況)
見下
總RNA
100-500ng
或poly(A) mRNA
10-500 ng
或體外轉錄得到的專一RNA
0.01 pg-500ng
RNA特異性引物一(自備)
終濃度300nM
終濃度300nM
RNA特異性引物二(自備)
終濃度300nM
終濃度300nM
探針(僅對Realtime RT-PCR)
終濃度200nM
終濃度200nM
RNase-free水
補到13 uL
補到13 uL
雙酶一管式RT-PCR Buffer(2×)
15 uL
15 uL
MMLV-Taq Mix
2 uL
2 uL
注:通常初次使用本試劑時,可用引物濃度300nM,探針濃度200nM進行實驗,根據實驗結果具體情況,在200~800nM范圍
   內調整引物濃度,在50~400nM范圍內調整探針濃度以達到最佳檢測效果。引物、探針、待檢樣品的具體加量用戶可
   以根據實際情況調整,同時增減DEPC水用量,保證總反應體積不變即可。
2.  輕柔混合均勻后放入PCR儀中進行RT-PCR。
3.  設定RT-PCR反應條件時,一般將RT的條件設定成42℃30分鐘,后接94℃變性5分鐘,然后進入PCR循環(PCR參數將根據自備引物的Tm值由用戶自行決定注)、最后72℃5分鐘。對Realtime PCR,在復性步驟設置熒光檢測,檢測通道:FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
4.   RT-PCR結束后取5-10 μL電泳檢查。
——— 保存條件
     低溫運輸,-20℃保存,有效期1年。
—— 注意事項
1.  使用已校準的移液器,選用一次性PCR反應管、離心管、tip頭等進行樣本處理及配液等操作,所有用具應不含DNA酶和RNA酶。
2.  引物、探針設計過程中應盡可能避免發夾結構、二聚體等現象的發生,探針的位置盡可能靠近上游引物, PCR目標片段最好小于200bp,盡可能在150bp以內。
3.  實驗樣品盡可能新鮮,提取過程應嚴防RNA酶污染及操作不當導致的RNA降解。
4.  使用本產品時建議對RT-PCR擴增條件、引物濃度和樣品用量進行調整,選擇最適當的引物濃度、樣品濃度和PCR擴增條件。
5.  本產品使用前應在室溫充分融解,并用漩渦震蕩器充分混勻。
6.  統一配液后分裝以減少加樣誤差,每次實驗應設置陰性對照。
7.  禁止標記PCR反應管,避免外源性熒光信號干擾。
8.   PCR反應管中不能有氣泡,否則會產生非特異的熒光信號。若有氣泡,可先用手指將氣泡彈破,然后再低速離心消除。
9.  實時熒光PCR儀器連續進行實驗時,最好間隔1小時以上再使用。
10.  實時熒光PCR儀需經常校正和清潔載樣板板孔。
11.  若使用Roch LightCyclerTM熒光PCR儀,應將毛細管放在專門套管中,以便分裝反應體系和加入待檢樣品。前述操作完畢應低速離心數秒再將毛細管垂直緩慢放入樣品架,以免折斷;若發生折斷,應小心取出,用專用小毛刷擦拭干凈后方可進行擴增。
12.  實驗室應嚴格分區,避免PCR產物污染。
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